新冠传染性为何超强？
新冠传染性为何超强？
借助强大的冷冻电子显微镜、生物化学技术与基因科技，科学家们试图解答「新冠为何传染力超强」这一问题
虽然在中国已得到控制，但在全球范围内， 新冠肺炎疫情 (COVID-19) 还处于大流行时期。截至 4 月 16 日，美国约翰斯·霍普金斯大学的实时数据显示，全球新冠肺炎确诊病例累计已突破 206 万；死亡病例达 13.7 万例。
四个月前 ，新冠病毒 (SARS-CoV-2) 刚在人群中暴发时，恐怕没人想到这场疫情会在数量级上远超出 SARS 的广度和烈度。据世界卫生组织 (WHO)，SARS 疫情自 2002 年末暴发至 2003 年 8 月结束，在全球共感染病例 8096 例，死亡 774 例。
哈佛大学流行病学专家马克·利普西奇 (Marc Lipsitch) 此前预测，最终全世界约 40% 至 70% 的成年人将感染新冠病毒。之后，他将这一数字修正为 20% 至 60% 的成年人会被感染。这意味着超过 10 亿人会感染新冠。如果预测成真，新冠将与鼠疫杆菌 (引发黑死病)、天花病毒以及 1918 年西班牙流感病毒一样，跻身历史上传染人数最多的 几种致命性病菌 之一。
流行病学上，衡量病毒传染能力的重要指标是基本传染数 (R0)。它是指在没有外力介入，同时所有人都没有免疫力的情况下，一个感染到某种传染病的人会把疾病传染给其他多少个人的平均数。R0 值越大，病毒的传染力越强。在没有防疫的情况下，若 R0 小于 1，传染病将会逐渐消失；若 R0 大于 1，传染病会以指数方式散布，成为流行病。
1 月 23 日，世界卫生组织发布声明称，初步估计新冠 R0 值在 1.5–2.5 之间。1 月 24 日，英国兰卡斯特大学、美国佛罗里达大学、英国格拉斯哥大学等组成的科研团队发表的一篇研究估算出新冠 R0 为 3.8。2 月 4 日，美国佛罗里达大学、北京大学、北京微生物流行病研究所、山东大学、美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心、中国疾控中心等单位的研究人员共同完成的一篇论文显示，新冠病毒 R0 值高达 3.77。《科学》杂志 3 月 6 日刊载的一篇论文通过传播模型估测，新冠 R0 为 2.57。
基本传染数会受到防疫力度、人群差异、环境条件和病毒自身变异等多种因素影响，尽管新冠病毒 R0 值的估算值多有不同，但大都高于 SARS 病毒 (SARS-CoV) 和 MERS (中东呼吸综合征) 病毒 (MERS-CoV)。一篇 2005 年的文献称，SARS 的 R0 值在 1.1–4.2 之间，大部分集中在 2–3 区间。MERS 的 R0 值则更低，约为 0.3–0.8。一般年份季节性流感的 R0 值大约为 1.28。1918 年西班牙流感的 R0 值则为是 1.80。
为何新冠病毒的传染力这么强？除了与其传播方式、途径、特点、环境存活力等因素相关，还与病毒的分子结构及其跟人体细胞受体的结合机制等有关。借助强大的冷冻电子显微镜、生物化学技术与基因科技，科学家们试图解答「新冠为何传染力超强」。
新冠如何劫持细胞
新冠是一种呼吸道传播疾病，通过呼吸道传播的病毒一大特点是传播速度非常快。不同于通过血液、性交、体液、消化道等方式传染的疾病如艾滋病、埃博拉、霍乱与天花等，呼吸道传播的病毒可以通过空气中的飞沫、接触以及特殊环境下的气溶胶传播，病毒可经过嘴、鼻、眼黏膜等进入人体。
实验证明，新冠病毒在环境中的存活力很强。美国国立卫生研究院 (NIH)、美国疾病控制与预防中心 (CDC)、普林斯顿大学等合作的研究表明，雾化新冠病毒能在气溶胶中存活 3 小时，在铜表面能存活 4 小时，纸表面 24 小时，塑料或不锈钢表面甚至长达 2 到 3 天。
和其他呼吸道病毒相比，新冠的临床传播特点显得更「狡猾」而难以防控。与 SARS 病情进展快且易于识别不同，很多新冠感染者在病毒潜伏期无发烧等症状，这使得体温排查的措施无效。此外，新冠存在大量无症状感染者，流行病学证据显示，无症状感染者亦有较强的传染能力。香港大学新兴传染病国家重点实验室主任袁国勇团队的最新研究成果显示，新冠病毒载量曲线与流感相似，在发病初期即出现峰值，这让大量隐性传播成为可能。
美国白宫首席传染病专家、NIH 传染病科主任安东尼·福奇 (Anthony Fauci) 就对媒体表示，这些年来他最担心的就是呼吸道相关疾病的新发病毒，「这类病毒的大暴发就是噩梦，埃博拉虽然致死率很高，但它只有在非常近距离接触特别重的病人时才会被传染。而新冠病毒一定程度上类似于流感病毒，却又不一样。它很容易传播，甚至有的无症状感染者也有传染性，它非常狡猾。但另一方面，季节性流感的死亡率是 0.1%，而新冠的感染死亡率高达至少 1%，是流感的 10 倍」。
病毒，是地球上最小，也是结构最简单的非细胞结构微生物。在电子显微镜下，新冠病毒直径约 100 纳米左右，大小仅为它所感染的人体细胞的百万分之一。如此小的病毒到底具有什么样的分子结构，使它能突破人体防线、吸附并侵入宿主细胞，并开始疯狂的自我复制？
「病毒通常比细胞要简单得多，绝大多数病毒只是蛋白质外壳包裹着几个基因而已。」《病毒星球》(A Planet of Viruses) 一书的作者、美国著名科普作家卡尔·齐默 (Carl Zimmer) 写道：「事实上，蛋白质占了病毒组成的 95%，另外 5% 是另一种神奇的长条状分子，也就是核酸 (DNA 与 RNA 的总称)。」
虽然结构极精简、体积极微小，但令人惊叹的是，小小的病毒却浓缩了大自然作为造物主那鬼斧神工的「设计才华」。最近，卡尔·齐默与《纽约时报》的科学图形编辑 Jonathan Corum 合作，共同发表了一篇文章题为「包裹在蛋白质里的坏消息：透视冠状病毒基因组」，将新冠病毒编码的 29 种蛋白质以模式图和文字的形式呈现出来。
这些蛋白质大分子分工明确、各司其职。有的似「剪刀」，可以把蛋白从长长的蛋白链上解放出来；有的似「梳子」，可以把缠绕在一起的 RNA 链解开，方便复制或蛋白翻译；还有的是「碎纸机」，可以切碎剩余的病毒 RNA，以免被人体的免疫系统发现。在生物化学的世界里，蛋白质就像勤劳的小蜜蜂，还划分了不同工种。
当然，并不是每一种蛋白的功能都已被科学家知晓。总体而言，可将冠状病毒的蛋白质分为结构蛋白、非结构蛋白和附属蛋白。其中，四种结构蛋白分别为刺突蛋白 (S)、小囊膜蛋白 (E)、基质膜蛋白 (M) 以及核衣壳蛋白 (N)。前三者位于新冠病毒的表面。而核衣壳蛋白在病毒的内部与遗传物质 RNA 装配在一起，起到保护遗传物质的作用。
非结构蛋白 (NSP) 只参与病毒的复制过程，在病毒颗粒装配完成以后便不复存在。上文中的「剪刀」「梳子」和「碎纸机」都是非结构蛋白。此外，还有一些是散落在结构蛋白之间的附属蛋白。之所以得此名，是因为即使删除这些基因，也不会对病毒的复制造成影响。同种冠状病毒间，变异最大的就是附属蛋白，非结构蛋白以及结构蛋白则相对保守。
这些蛋白中，被结构生物学家研究最多的，就是大名鼎鼎的 S 蛋白。它是结构蛋白的一种，位于新冠病毒最外层。冠状病毒得其名，便是因为这些突起的刺突蛋白使整个病毒看上去就像一顶皇冠 (crown)。
如果把新冠病毒想象成一个入室抢劫的强盗。病毒表面的 S 蛋白就是钥匙，而在人体细胞表面表达的一种蛋白酶 ACE2 (血管紧张素转换酶 2) 受体则是细胞工厂的「门把手」。当 S 蛋白紧紧抓住门把手时，病毒才能闯入人体细胞。ACE2 是人体内一种参与血压调节的蛋白，大量分布于人的口鼻、呼吸道结膜的黏膜上皮细胞中，且在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在。
但进入细胞工厂只是第一步，病毒真正要做的是劫持细胞的强大「资源」，使其成为一个「代工厂」。新冠病毒进入细胞后脱壳释放其遗传物质 RNA，利用宿主细胞内的各种「机器」完成 RNA 的复制和蛋白的翻译，这一过程为生物合成。新生产出来的核酸和蛋白再装配出成无数个子代病毒颗粒，不断循环往复。
这是一桩成本极低的生意，当病毒把自己的基因和蛋白质注入宿主细胞，它只需利用自己携带的一份说明书，便能生产出病毒所需要的各种零配件，之后再组装成无数的病毒，这些子代病毒再从细胞破壁而出，涌向更多的「细胞工厂」……
新冠病毒所携带的这份「说明书」，就是它的遗传物质——单链 RNA。在 RNA 的指导下，细胞合成蛋白质和其他分子。将这条神奇的核酸长链展开，可以发现它由 3 万多个碱基组成，而且只有四种可能——A 腺嘌呤、G 鸟嘌呤、C 胞嘧啶和 U 尿嘧啶。每 3 个碱基组成一个密码子，每个密码子都代表了一种特定的氨基酸或者终止信号，最终这些氨基酸再聚合成大分子蛋白质。
超强的亲和力
科学家首次看清 ACE2 全貌及其与新冠 S 蛋白的相互作用，是在今年 2 月下旬。2 月 21 日凌晨，西湖大学周强实验组在论文预印本网站 bioRxiv 上发文，报道新冠病毒表面 S 蛋白受体结合结构域与细胞表面受体 ACE2 全场蛋白的复合物冷冻电镜结构。该文已于 3 月 27 日作为《科学》杂志当期封面文章发表。他们发现，在形态上，新冠病毒的 S 蛋白像一座桥横跨在 ACE2 表面，又像病毒的一只手，紧紧抓住 ACE2。这一点与 SARS 病毒很相似。新冠病毒 S 蛋白的受体结合结构域与 SARS 病毒的序列也非常像，相似性达到 82%。
周强团队对比此前已经解析出来的 SARS 病毒与 ACE2 的相互作用，新冠病毒 S 蛋白有一部分氨基酸残基发生了较大改变。他们认为，这也许可以解释为什么新冠病毒及 SARS 病毒与 ACE2 受体的结合能力不一样，这种结合能力可能影响了病毒的传染力。
比周强团队稍早几天，也有美国学者对 S 蛋白与 ACE2 受体的亲和力给出了定量计算结果。美国得克萨斯大学奥斯汀分校的杰森·麦克莱伦 (Jason S Mclellan) 是研究病毒结构的专家，在 MERS 病毒和埃博拉病毒的结构方面做过很多研究。2 月 17 日，他的团队发表预印文章称，利用冷冻电镜技术解析了新冠病毒的 S 蛋白结构，且发现 ACE2 蛋白与新冠病毒的亲和力是 SARS 病毒的 10–20 倍，该文也于 2 月 20 日正式发表在《科学》杂志上。
为了解析新冠病毒 S 蛋白的结构，麦克莱伦团队根据已公开的新冠病毒基因组序列，合成并纯化了新冠病毒 S 蛋白的膜外部分。但表达出这种蛋白质之后，又如何能看清它的三维结构呢？对同一个生物大分子，科学家可以从不同角度获取它的「快照」，再将这些二维图片整合到一起，就可以在计算机上重建出它的三维结构。麦克莱伦等人就是用冷冻电镜纯化的 S 蛋白拍了 3207 张照片，经过 3D 重建，获得了分辨率为 3.5 埃 (1 埃=0.1 纳米) 的 S 蛋白三聚体结构。每一个 S 蛋白单体中约有 1300 多个氨基酸，其中 300 多个氨基酸构成了受体结合结构域 (RBD)，即 S 蛋白与 ACE2 相联结的地方。
接着，麦克莱伦又利用了一种近年来已被广泛用来研究蛋白质、多肽、小分子化合物等生物分子之间相互作用的仪器——生物大分子相互作用仪器 BIACORE，观察了 S 蛋白与 ACE2 受体结合的能力。这个仪器由传感器芯片、SPR 光学检测系统以及微射流卡盘三个核心部件构成。在实验时，可以将一种生物分子固定在传感器的葡聚糖表面，然后将与之相互作用的分子溶于溶液，使其流过芯片表面。这样 SPR 检测器就能追踪到溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离这整个过程的变化，并记录成一张传感图，从而提供动力学和亲和力的数据。
此处的亲和力 (affinity) 并非一个力学概念，而是指「能力」，也有学者提倡将其翻译为「结合亲和性」，以避免与物理化学中定义的相互作用力混淆。在物理化学中，亲和力的强弱由平衡解离常数 (KD) 来表示，有时也简称「亲和力常数」。通常而言，平衡解离常数数值越小，亲和力越大。「KD 的单位 mol/L 是浓度单位，不妨看成浓度。那么 KD 的直观物理意义是复合体在 KD 这个浓度下，有一半的分子处于结合状态。」暨南大学生命与健康工程研究院张弓教授向财新记者介绍。
麦克莱伦团队的实验结果出乎人们的意料，SARS 病毒的 S 蛋白与 ACE2 的平衡解离常数为 325.8nM (n mol/L 纳摩尔每升)，而新冠病毒的 S 蛋白与 ACE2 的平衡解离常数 KD 竟然只有 15nM。这意味着，SARS 病毒蛋白浓度在 325.8nM 时，才能有一半的 ACE2 与 S 蛋白结合。但新冠病毒的蛋白浓度只要达到 15nM，就能有一半的 ACE2 与 S 蛋白结合。因此，新冠蛋白 S 蛋白与 ACE2 受体的亲和力是 SARS 病毒的 10–20 倍。
需要特别指出的是，病毒的亲和力并不能与其传染性划上等号。中国医学科学院基础医学研究所副所长、北京协和医学院免疫学系副主任黄波在接受媒体采访时曾表示，上述美国科学家的研究结果只能说明新冠病毒比 SARS 病毒更容易进入人体细胞，这与病毒的传染性可能有一定关系，但并不能断定新冠病毒的传染性就是 SARS 病毒的 10–20 倍。病毒的传染性除了与进入人体细胞的容易程度有关外，还与机体免疫力、病毒在细胞内的复制快慢等多种因素有关。
由于基因突变和自然选择，S 蛋白与 ACE2 受体的亲和力也并非是一成不变的。病毒学常识中，RNA 病毒变异速率很快，其数量级约为每年 0.1%。原因是病毒 RNA 聚合酶在工作时没有纠错机制，往往一直将错就错下去，所以 RNA 病毒复制的错误率比人和动物的 DNA 聚合酶出错率要高出上万倍。已有科学家发现，新冠病毒在繁殖倍增过程中，其受体结合结构域发生的突变，似乎在这使这种亲和力变得更强。
3 月 17 日，论文预印平台 bioRxiv 上发表了一篇由南方医科大学公共卫生学院教授张其威、暨南大学生命与健康工程研究院张弓共同担任通讯作者的研究，称 RBD 突变增强了新冠病毒表面 S 蛋白的结构稳定性，突变病毒株与受体结合的亲和力显著增强。研究称，新冠传染性提高应该是大概率事件。
研究团队从公共数据库 (美国国家生物信息中心的 DNA 序列数据库 GenBank 和全球共享流感数据库 GISAID 等) 下载了 244 条新冠病毒毒株的基因序列全长，并筛选出 S 蛋白及其 RBD 区域发生突变的序列进行分析。从研究者绘制的毒株序列分布地图来看，现阶段这 244 个新冠病毒毒株中，绝大多数毒株的 S 蛋白受体结合结构域没有发生突变，只有 10 条序列在 RBD 区域存在 1 个或 2 个氨基酸的突变。
他们又通过分子动力学的模拟计算来评估 RBD 突变体与 ACE2 受体的结合能力，结果发现有 3 个突变体的 KD 值引人关注，分别为 0.12nM、0.11nM、0.13nM，与最早上传的来自武汉原始毒株的 KD 值 14.7nM 相比，相差两个数量级。
「武汉原始病毒株的 KD=14.7nM，即当病毒蛋白浓度为 14.7nM 时，有一半的 ACE2 能与病毒蛋白相结合。突变后，KD=0.11nM，即当病毒蛋白浓度为 0.11nM 时，有一半的 ACE2 能与病毒蛋白相结合。这意味着，突变后，只需要百分之一不到的病毒蛋白数量 (可以等效为病毒粒子数量)，就能达到同样的结合效果。因此突变增强传染性，是很明显的事情。」张弓也强调，病毒亲和力提高 100 倍并不意味着传染性提高 100 倍，因为 RBD 与 ACE2 的结合虽是新冠病毒感染人体必不可少的第一步，但要达成真正的感染还有很多其他步骤，且受其他因素的影响。尽管如此，传染性提高应该是大概率事件。他近日还告诉财新记者，已在团队实验室中成功表达了 V367F 这一个突变，实验结果也证明了此前的计算结果——RBD 突变对人 ACE2 的亲和力有了显著提高。
「其实这很好理解，在严厉的隔离防控之下，病毒很难接触到易感者，所以病毒如果不能突变出高传染性，没多久就灭绝了。如此大的防控压力，筛选出『超级病毒』是完全可以理解的，正如强大的抗生素压力能筛选出超级细菌一样。」张弓说。
独特的酶切位点
新冠感染力缘何超强的答案，还可以在其基因序列中找到。如果把由 3 万多个碱基组成的那条新冠单链 RNA 比作病毒复制工作的「说明书」，摊开这份 3 万字的说明书，一串神秘的字母中也蕴藏着病毒高效入侵人体细胞的秘密。
科学家们在新冠表达 S 蛋白的基因中发现了长达 12 个碱基的插入——CCUCGGCGGGCA，它们共同形成了一个重要的蛋白酶切位点。所谓酶切位点，是指一段特定的碱基序列，限制性内切酶能识别出这个序列并在此将 DNA 或 RNA 序列切成两段。
这段插入是在 S 蛋白的 S1 亚基与 S2 亚基之间的交界区被发现的。S1 和 S2 蛋白亚基是 S 蛋白的两个功能单位，S1 负责与受体 ACE2 结合，S2 负责病毒与细胞膜融合。
1 月 27 日，来自南开大学、齐鲁师范学院的研究者在中科院科技论文预印平台 chinaXiv 发布论文称，他们在新冠病毒 S 蛋白 S1 亚基与 S2 亚基之间交界区的氨基酸序列中无意发现了「RRAR」序列，该序列符合弗林酶 (Furin) 切位点的识别模式「RXXR」，新冠病毒基因组可能存在 Furin 蛋白酶切位点。这是此前所有已知 SARS 和类 SARS 冠状病毒所不具备的，这种变异有可能增强了新冠病毒的传播能力。
此后，有多项国内外研究都聚焦于 S 蛋白内这一独特的插入位点。多项研究提出，PRRA 的插入可能使 S 蛋白发生裂解，从而触发病毒与细胞膜快速融合。3 月 2 日，来自中国医学科学院北京协和医学院、中国疾控中心、加州大学洛杉矶分校、匹兹堡大学、湖南大学等单位的科研人员在 bioRixv 平台上发表了一项研究。他们通过实验证明，PRRA 的插入可能使 S 蛋白酶切裂解效率提高，从而导致病毒入侵细胞效率提高。如果在 SARS 病毒中引入一个酶切位点，会导致 S 蛋白的裂解并增强膜融合性。此外，在 SARS 假型病毒中引入一个裂解的 S 蛋白，也会使其能够直接进入宿主细胞。
但弗林酶切位点的发现，也引来了一系列风波。一种新冠病毒「人造论」也随之被提出，一个关键论据就是弗林酶切位点在蝙蝠携带的冠状病毒中并不存在，引入它需要插入一段由 4 个密码子、共 12 个碱基组成的特殊序列。据传统的分子进化中性学说，短期自然进化没有可能导致如此长的序列插入，很可能是人为插入。「如果新冠病毒基因序列中这 12 个碱基的插入解释不清楚，很容易被加工成『人造病毒』阴谋论。」南开大学生命科学学院副教授高山说。
不过，此后科学家们不断找到的新证据正在击碎这种阴谋论。3 月 6 日，一篇发表在 bioRxiv 预印本网站的论文称，S 蛋白两个亚基 S1 和 S2 间的蛋白酶切位点有多个碱基插入，并非新冠病毒独有，一种新的蝙蝠冠状病毒 RmYN02 的 S 蛋白同样存在类似插入。研究团队认为，这一结果有力证明了类似插入可以自然发生，来自蝙蝠的冠状病毒可能提供了新冠病毒的基因骨架，与蝙蝠或其他野生动物的进一步重组事件，则使它获得了 S 蛋白、RBD 和多碱基剪切位点。
参与该项研究的机构包括中国科学院武汉病毒研究所、山东第一医科大学、中国科学院西双版纳热带植物园、中国科学院北京生命科学研究所、中国科学院微生物研究所和悉尼大学等。论文尚未经同行评议。
该研究的通讯作者之一、中国科学院西双版纳热带植物园副研究员 Alice Catherine Hughes 曾对财新记者表示：「人工干预没有任何证据，这种病毒显然是从野生动物起源和进化而来的。」
也有科学家通过搭建模型提出，可通过突变获得这种插入，并在禽流感病毒毒株中恰好找到了一模一样的 12 碱基插入。3 月下旬，高山等人在 ResearchGate 网站上发表预印文章「2019 新型冠状病毒获得 Furin 酶切位点的突变模型」，称其构建的突变模型揭示了自然突变如何导致新冠病毒获得弗林酶切位点。文章未经同行审议、未正式发表。
为了证明模型的可靠性，高山等人又将该模型应用于解释禽流感病毒获得 Furin 酶切位点。他们在禽流感毒株中恰好找到了一个 12pb 的插入——由原来的 3 个 A 扩张成 15 个 A，其中又有两个 A 突变为 G，形成了一个弗林酶切位点「RKKR」。
「个体内的动物线粒体和病毒的非中性突变大部分是有害的，有利的突变——例如新冠病毒获得 Furin 位点这个案例，所占的比例极低，因此客观上要求个体内发生极大量的非中性突变。一旦获得合适的条件，有利的突变体即可迅速扩张，这一点正好解释新冠病毒获得弗林酶切位点后得以广泛传播。」高山说。
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